Медицинская биология. Методы генетики В чем заключается цитогенетический метод
Для качественной своевременной диагностики врожденных заболеваний, предрасположенности к онкологическим патологиям используется цитогенетическое исследование.
С помощью современных методик и новейшего оборудования изучается хромосомный набор плода.
Найденные аномалии в хромосомном аппарате позволят выявить и предотвратить возможные патологии еще до рождения ребенка.
Данная процедура отличается сложностью и многоступенчатостью, поэтому для решения каждой отдельной диагностической задачи требуется свое цитогенетическое специализированное обследование.
Цитогенетическое исследование изучает связи между наследственными факторами и ядерными структурами соматических клеток человека.
Данные методы анализа широко используются в биологии и медицине для определения происхождения, эволюции, изменчивости живых существ на протяжении филогенеза и онтогенеза.
Особое внимание уделяется индивидуальным генетическим особенностям. Именно поэтому главным предметом, с которым работает цитогенетический метод исследования, является хромосомный набор человека, животных и растений.
Изменения в хромосомах, передаваясь по наследству, определяют признаки организма, его подверженность различным заболеваниям, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды.
Именно хромосомы определяют передачу некоторых заболеваний, поэтому по их набору и структурным изменениям можно увидеть предрасположенность конкретного человека к развитию онкологических и других тяжелых болезней.
Разнообразные структурные перестройки хромосом, аномалии хромосомного набора выявляет цитогенетический анализ и исследование.
Такие методики применяются для современной диагностики опасных заболеваний на начальных стадиях их развития.
На ранних стадиях беременности применение цитогенетического исследования хромосом плода позволяет определить пол будущего ребенка на клеточном уровне.
Высокотехнологичное оборудование последнего поколения, проверенные методики исследования позволяют обнаруживать и предотвращать онкологические заболевания и генетические патологии.
Точная диагностика дает возможность определить наиболее оптимальную тактику лечения, которая будет способствовать положительному терапевтическому результату.
Успешность такой процедуры зависит от качества, точности оборудования, квалификации, опыта медицинского персонала.
Точные данные анализа хромосом определяют успешность всего последующего лечения, поэтому необходимо стараться с первого раза получить правильные результаты.
Иногда данный вид диагностики оказывается единственно возможным. Эта технология исследования позволяет создать большое количество копий ДНК, которые исследуются различными способами, повышая достоверность результатов.
Выявленная на ранних стадиях болезнь лечится намного легче, а эффективная быстрая терапия зачастую спасает жизнь.
Исследование кариотип
Хромосомный набор (кариотип) изучается несколькими способами, которые используют различный биологический материал для анализов.
Исследование кариотип чаще всего работает с венозной кровью, которая смешивается в пробирке с литием и гепарином.
Забор крови производится в количестве 2 мл, после чего она содержится внутри питательной среды на протяжении 3 суток. Только после этого полученный материал фиксируется и исследуется под микроскопом.
За месяц до анализа хромосом следует отказаться от приема антибиотиков, кроме того, такие процедуры не проводятся при простудных заболеваниях.
Исследования кариотипа (кариотипирование) анализирует с помощью методики световой микроскопии форму, размер, число хромосом, используя специальное окрашивание. Нормальные показатели у мужчин обозначаются 46,XY, а у женщин – 46,XX.
Кариотипирование исследует структурные аномалии генетического материала, которые связаны с разрывами хромосом. Эти разрушения компенсируются с помощью различных нездоровых аномальных комбинаций.
С развитием современной медицинской техники появляются новые цитогенетические методики исследования, которые эффективно идентифицируют такие патологические изменения хромосом.
Если существуют подозрения на генетические отклонения в развитии эмбриона человека, то отдельно производится цитологический анализ плода.
Современные медицинские центры с хорошим оборудованием и квалифицированным персоналом выявляют различные пороки развития, хромосомные болезни, с достаточно высокой точностью определяют возможности благополучно выносить ребенка.
Если есть подозрения на онкологические заболевания органов системы кроветворения, то назначается цитологическое исследование костного мозга.
Такие анализы проводятся только в медицинских учреждениях, которые имеют специальное оборудование и квалифицированный персонал.
Это вызвано тем, что забор биологического материала для анализа и исследования связан с опасностью для здоровья и жизни.
С целью исключения хромосомных заболеваний плода на 3-4 месяце беременности проводится анализ хориона, который исследует не менее 20 клеток системы кроветворения.
Такое тестирование поможет предвидеть такие патологии, как болезнь Хантера, синдром Дауна и многие другие заболевания.
Изменение набора хромосом при онкологических процессах может быть использовано для ранней диагностики рака, поэтому диагностические исследования на цитологическом уровне активно развиваются с ростом технического прогресса.
Задачи анализа кариотипа и его виды
Подробное изучение кариотипа проводится для решения следующих конкретных задач:
- уточнения диагностического основания для назначения оптимального лечения онкологических заболеваний;
- выявления причины врожденных заболеваний ребенка на генетическом уровне;
- нахождение генетических причин выкидыша, женского бесплодия;
- выявление последствий воздействия вредных факторов на работе;
- обнаружения аномальных хромосом у плода.
Таким образом, показаниями к проведению подобного анализа являются бесплодие, прерывание беременности, подозрение на хромосомные патологии, отсутствие менструаций у женщин половозрелого возраста, нарушения и задержки полового развития.
Хромосомные аномалии у плода нередко могут становиться причиной неразвивающейся беременности.
В зависимости от уровней проведения анализ кариотипа бывает двух видов:
- обычным;
- молекулярным.
Если нарушение нормального кариотипа происходит на ранних стадиях полового развития человека, то при слиянии половых клеток и образовании зиготы такие аномалии сохраняются.
В дальнейшем развитии эмбрион сохраняет патологические неправильные хромосомы. Такое положение приводит к патологическим изменениям индивидуального развития, которые нередко оказываются нежизнеспособными.
Однако бывает положение, когда изначально при делении зиготы развивается несколько линий делений клеток, которые имеют разные кариотипы. Это позволяют выявить обычные цитогенетические методы исследования.
Молекулярное кариотипирование является самым современным методом исследования генома человека. С помощью такого анализа появилась возможность выявлять различные вариации числа копий генов.
Такие патологии характеризуются потерями участков молекул ДНК, которые содержат важную генетическую информацию. Все это приводит к умственной отсталости, эпилепсии, раку, аутизму.
С помощью этого метода можно достаточно точно определить гены, которые находятся в области перестройки, выяснить их непрямой или непосредственный вклад на развитие генетических заболеваний.
На сегодняшний день этот метод является важнейшим инструментом для постановки точного диагноза большинства генетических патологий.
Процедура кариотипирования
Набор внутри соматических клеток организма, состоящий из 23 пар хромосом, одна из которых передается от матери, а другая – от отца, представляет собой кариотип человека.
Для проведения анализа кариотипа используются любые клетки, которые могут быть получены из крови, костного мозга, эпителия человека.
На протяжении клеточного цикла внешний вид хромосом значительно меняется. На одних стадиях митоза они располагаются внутри ядра, не имеют спиральной формы, а на других образуется спиральная структура большего размера.
Наиболее подходящий для внешнего наблюдения этап клеточного деления – метафаза. Именно на этой стадии можно проводить микроскопическое исследование хромосом.
Исследовательская процедура проводится в следующем порядке:
- Митоз останавливается на стадии метафазы и с помощью добавления колхицина, который фиксирует незаконченный процесс деления клеток, выделенная клеточная структура обогащается;
- Такие клетки окрашиваются, фиксируются, после чего их фотографируют под микроскопом;
- Полученные фотографии гомологичных хромосом систематизируются и выкладываются в определенном порядке.
С появлением методов дифференциальной окраски хромосом стала возможна их более подробная детализация при микроскопическом исследовании. Со временем эта методология совершенствовалась и развивалась.
Сдать анализ на определение кариотипа можно во многих специализированных клиниках. При этом такая процедура может проводиться в двух вариантах.
В первом случае анализируются количественные и структурные изменения хромосом, полученных от родителей.
Во втором анализируются внутренние мутации хромосом под влиянием неблагоприятных внешних факторов.
Нередко кариотипирование назначается супругам для определения причин бесплодия. При этом сдача биологического материала на анализ может происходить в разное время.
Таким образом, анализ кариотипов имеет большое значение в медицине, поскольку позволяет определять хромосомные перестройки, нарушения их структуры и порядка.
Цитогенетические обследования диагностируют ряд генетических заболеваний, которые напрямую связаны с хромосомами.
Клиническая генетика. Е.Ф. Давыденкова, И.С. Либерман. Ленинград. «Медицина». 1976 год.
ВЕДУЩИЕ СПЕЦИАЛИСТЫ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ
Амелина Светлана Сергеевна - профессор кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, доктор медицинских наук. Врач генетик высшей квалификационной категории
Дегтерева Елена Валентиновна - ассистент кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, врач-генетик первой категории
Редактор страницы: Крючкова Оксана Александровна
К цитогенетическим методам, применяемым в клинике, относятся определение полового хроматина (X- и У-хроматина) в интерфазных ядрах различных тканей, морфологических особенностей хроматина в нейтрофилах периферической крови (барабанные палочки), а также исследование хромосом на стадии метафазы митоза для определения кариотипа.
Исследование полового хроматина
В 1949 г. Ваrr и Bertram описали в интерфазных ядрах компактное скопление хроматина в виде темноокрашенного тельца, получившее название полового хроматина (sex chromatin). В норме он встречается у женщин, у мужчин он отсутствует или представлен в незначительном количестве. У мужчин, имеющих одну Х-хромосому, она всегда активна, у женщин активной является только одна из двух Х-хромосом, вторая находится в неактивном, спирализованном состоянии. Она образует тельце полового хроматина, которое определяется в интерфазном ядре клетки женского организма. Был разработан простой и быстрый метод определения Х-хроматина в мазках слизистой полости рта с окраской препаратов ацетоорсеином. Быстрота и легкость выполнения привели к широкому применению этого метода в медицинской практике.
Метод, до настоящего времени имевшийся в нашем распоряжении, выявлял только Х-хроматин, т. е. хроматин, образованный инактивированной Х-хромосомой. С момента опубликования исследований Caspersson с соавт. (1969, 1970) появились возможности определения У-хроматина при помощи люминесцентно-микроскопического исследования. Работами Zech (1969) было показано, что часть длинного плеча У-хромосомы флюоресцирует при окрашивании акрихин-ипритом. Затем Pearson с сотр. (1970) обнаружили, что в интерфазном ядре клеток мужчин имеется флюоресцирующее тельце, названное ими F-тельцем, которое у мужчин с кариотипом ХУУ имеется в двойном количестве. Таким образом, появился
простой метод определения У-хроматина в буквальных соскобах, который может быть применен для клинических целей. Это очень удобно для популяционных исследований, так как полное карио- типирование является сложным и трудоемким.
Таким образом, в настоящее время необходимо дифференцировать X-хроматин и У-хроматин.
Исследование Х-хроматина. Х-хроматин может быть определен в различных тканях организма: в клетках кожи, слизистой оболочки рта, уретры, влагалища, в клетках крови, в клетках волосяной луковицы, в эпителиальных клетках осадка мочи, в амниотической жидкости и др. Он может быть исследован и в посмертном материале, например в клетках почечных канальцев мертворожденных детей (Н_ П. Бочков и сотр., 1966).
Наиболее распространенным является определение полового хроматина в буккальных мазках по методу Sanderson и Stewart (1961) с одномоментной фиксацией и окраской препаратов ацетоорсеином.
Соскоб берется металлическим шпателем с внутренней поверхности щеки, наносится равномерным слоем на предметное стекло, окрашивается одной каплей 1,5% или 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина. Раствор красителя готовится следующим образом: в 45 мл ледяной уксусной кислоты растворяется 1,5-2 г орсеина; раствор нагревается до появления паров, добавляется 55 мл дистиллированной воды и после охлаждения фильтруется. Затем препарат накрывается покровным стеклом, на которое производится легкое надавливание через сложенную в 3-4 слоя марлю или фильтровальную бумагу для удаления лишней краски. На приготовление препарата требуется 2-3 мин. Если препараты просматриваются не сразу, то края покровного стекла покрываются парафином для предупреждения от высыхания. В таком виде препараты можно сохранять в холодильнике до 2 суток.
Ацетоорсеин окрашивает Х-хроматин в темно-фиолетовый цвет, а нуклеоплазму - в бледно-розовый.
Для более контрастного окрашивания Х-хроматина или при отсутствии ацетоорсеина в нашей лаборатории с успехом применяется метод окраски, разработанный сотрудником нашей лаборатории- А. М. Захаровым. Он основан на метахроматическом окрашивании гетерохроматина красителями тиозиновой группы: метиленовый синий, азур I. Эти красители отечественного производства обычно имеются в достаточном количестве в любой лаборатории.
Применяется 0,2-0,5% раствор одного из вышеуказанных красителей в дистиллированной воде. Разведение проводится из расчета 20-50 мг красителя на 10 мл Н20. Для приготовления одного препарата требуется 2-3 капли раствора. Требуется довести раствор до pH 4,3-4,7 несколькими каплями фосфатного буфера. Употребление буфера не всегда обязательно, так как при растворении краситель сам снижает значение pH до нужной величины. Приготовление препаратов проводится таким же образом, как при ацетоорсеиновом методе.
В отличие от орсеинового метода окрашивание производится без одновременной фиксации кислотой, что предотвращает сморщивание части клеток, поэтому количество Х-хроматина при подсчете превышает в среднем на 5% то количество, которое получается при ацетоорсеиновом методе. При этом методе окрашивания цитоплазма клеток эпителия бесцветна, ядра приобретают бледно-фиолетовый цвет, тельце полового хроматина окрашивается более интенсивно и имеет красноватый цвет.
Для подсчета полового хроматина используются микроскопы МБИ- 3 или МБИ-6 с иммерсионными объективами. Подсчитывается не менее 100 пригодных для анализа ядер, при этом учитываются ядра с ровным контуром, гладкой оболочкой и половым хроматином, прилегающим к ядерной оболочке. Просматривается обычно несколько полей зрения в разных местах препарата.
По количеству телец Х-хроматина можно судить о количестве Х-хромосом. Число Х-хромосом всегда на единицу больше числа телец полового хроматина.
В последние годы получило распространение определение полового хроматина в клетках опухолей. Обнаруживается несоответствие между полом больного и «клеточным полом» опухоли. Выявляется также зависимость между содержанием полового хроматина и чувствительностью опухоли к гормонотерапии.
Исследование У-хроматина. Определение У-хроматина в ядрах клеток на стадии интерфазы может быть осуществлено при применении флюорохромных красителей, таких как акрихин или акрихин-иприт с последующей люминесцентной микроскопией. Таким образом могут быть идентифицированы хромосомы на стадии метафазы митоза, а, также хроматин в ядрах клеток. Акрихин-иприт окрашивает дистальные участки длинных плеч У-хромосомы в метафазе. Кроме того, маленькие округлые флюоресцирующие
тельца наблюдаются в интерфазных ядрах. Они встречаются у лиц мужского пола и могут рассматриваться как У-хроматин. При хромосомных нарушениях типа ХУУ наблюдается два тельца У-хроматина (рис 5). Большие популяционные исследования показали, что наиболее удобными для выявления У-хроматина
Рис. 5. Два флюоресцирующих тельца У-хроматина в интерфазном ядре больного с синдромом 47, XYY.
Окраска акрихин-ипритом.
являются эпителиальные клетки слизистой щеки и лимфоциты периферической крови (Pearson и сотр., 1970; I’olani и Multon, 1971; Robinson, 1971).
Сейчас усиленно изучаются особенности F-хроматина в норме и патологии, вариации в связи с возрастом, различным состоянием организма, корреляцией с размером флюоресцентной части метафазной У-хромосомы и др.
Соскоб эпителия слизистой щеки, полученный при помощи шпателя, наносится ровным слоем на покровное или предметное стекло. Высушенные мазки фиксируют в абсолютном метиловом спирте в течение 2 мин, а затем проводят через нисходящий ряд спиртов (этиловый спирт), выдерживая по 30 с в каждом, до воды. Мазок помещают в буфер Мак-Илвейна (pH 7,0) на 8 мин при 8°. Мазки окрашивают в течение 8-10 мин в 0,005% растворе акрихин-иприта. Затем препараты споласкивают в свежей водопроводной воде и дифференцируют в двух-трех порциях цитратно- фосфатного буфера Мак-Илвейна по 1-2 мин и заключают в смесь вода-глицерин (1: 1). Излишки среды тщательно удаляют фильтровальной бумагой и края покровного стекла заливают парафином.
Препараты анализируют под люминесцентным микроскопом (МЛ-2 или МЛ-3, лампа ДРШ 250 с фильтром ФС-2 и СС-2 и барьерным фильтром ЖС 18 + ЖЗС 19).
В ядрах клеток буквального эпителия У-хроматин обнаруживается в виде ярко светящихся телец на фоне умеренного свечения остального хроматина ядра. Общее количество клеток с У-хроматином колеблется от 33 до 92%. Размер одиночного тельца У-хроматина около 0,25-0,8 мкм в диаметре. Но У-хроматин может быть представлен в виде одной, двух, трех и более мелких глыбок в ядре. Интерфазный У-хроматин коррелируется с вариациями в размерах флюоресцирующих участков У-хромосом в метафазных пластинках.
Исследование У-хроматина люминесцентно-микроскопическим методом в комплексе с методом определения Х-хроматина дает возможность выявлять набор половых хромосом без кариотипирования. Исследование эндоцервикальных мазков с помощью флюоресцентной методики можно использовать для пренатального определения пола.
В генетике человека используются разнообразные методы исследования, применяемые и в других разделах биологии - генетике, физиологии, цитологии, биохимии и др. Антропогенетика располагает также собственными методами исследования: цитогенетическим, близнецовым, генеалогическим и др. 4
Достижениями молекулярной биологии и биохимии внесен большой вклад в развитие генетики. В настоящее время биохимическим и молекулярно-генетическим методам исследования принадлежит ведущая роль в генетике человека и медицинской генетике. Однако и классические методы генетики человека, такие как цитогенетический, генеалогический и близнецовый, имеют существенное значение в настоящее время, особенно в вопросах диагностики, медико-генетического консультирования и прогнозирования потомства.
Ознакомимся с возможностями цитогенетического метода.
Суть этого метода заключается в изучении строения отдельных хромосом, а также особенностей набора хромосом клеток человека в норме и патологии. Удобным объектом для этого служат лимфоциты, клетки эпителия щеки и другие клетки, которые легко получать, культивировать и подвергать кариологическому анализу. Это важный метод определения пола и хромосомных наследственных заболеваний человека.
Основой цитогенетического метода является изучение морфологии отдельных хромосом клеток человека. Современный этап познания строения хромосом характеризуется созданием молекулярных моделей этих важнейших структур ядра, изучением роли отдельных компонентов хромосом в хранении и передаче наследственной информации.
В главе 1 мы рассмотрели такие компоненты хромосом, как белки и нуклеиновые кислоты. Здесь же кратко остановимся на строении и морфологии хромосом.
Строение хромосом.
Хромосомную теорию наследственности создал американский ученый Т. Г. Морган. Проведя большое количество исследований на плодовой мушке дрозофиле, Морган и его ученики установили, что именно в хромосомах находятся открытые Менделем факторы наследственности, которые были названы генами. Т. Морган и его ученики показали, что гены расположены линейно по длине хромосомы.
После того как было доказано, что хромосомы являются основными генофорами (носителями генов), начался период их наиболее интенсивного изучения. Успехи молекулярной биологии и генетики позволили понять некоторые закономерности строения и функционирования хромосом прокариот и эукариот, однако многое здесь остается еще неизвестным. В последние годы хромосомы эукариот, особенно человека, становятся предметом изучения различных специалистов, начиная от генетиков и кончая физиками.
Внастоящее время установлено, что в основе строения хромосомы лежит хроматин - сложный комплекс ДНК, белков, РНК и других веществ, входящих в хромосому (строение хроматина мы подробно рассмотрели в главе 1). Предполагается, что в хромосому человека входит одна гигантская молекула ДНК, молекулы РНК, гистоны и кислые белки, различные ферменты, фосфолипиды, металлы Са 2+ , Mg 2+ и некоторые другие вещества. Способ укладки и взаимного расположения молекул этих химических соединений в хромосоме пока не известен. Длинная нить ДНК не может располагаться в хромосоме беспорядочно. Существует предположение, что нить ДНК упакована закономерным образом и связана с белками.
Ф. Арриги и соавторы (1971) установили, что уникальные последовательности занимают более 56% ДНК хромосом человека, высокоповторяющиеся - 12,4 %, промежуточные повторы - 8 %. Общее количество повторяющихся генов в ДНК хромосомы человека равно 28%. Число хромосом у человека длительное время оставалось невыясненным. Дело в том, что определить количество хромосом у млекопитающих, особенно у человека, было трудно. Хромосомы оказались маленькими, весьма многочисленными, плохо поддавались подсчету. При фиксации клетки они сливались в комки, что затрудняло определение истинного числа хромосом. Поэтому первые исследователи не могли точно и правильно подсчитать количество хромосом в клетках человека. Называлось разное количество хромосом - от 44 до 50.
О
бычно
хромосомы в клетках наблюдают во время
митоза на стадии метафазной пластинки.
В интерфазном ядре хромосомы в световой
микроскоп не видны. В
1912 г. Г.
Винивартер, изучая хромосомы в
сперматогониях и оогониях половых желез
человека, удаленных во время операции,
установил, что мужской набор хромосом
(кариотип) содержит
47 хромосом,
а женский
- 48. В
1922 г. Т.
Пайнтер повторил исследования Винивартера
и установил, что мужской и женский
кариотипы содержат по
48 хромосом,
но женский отличается от мужского только
двумя хромосомами. У женщин находится
2 большие
половые хромосомы, а у мужчины одна
большая Х-хромосома и одна маленькая
К-хромосома. В последующие годы эту
точку зрения поддерживали и другие
ученые. П. И. Живаго и А. Г. Андреа
(1932) предложили
первую классификацию хромосом в
зависимости от их длины. Так как хромосомы
очень близко располагаются одна около
другой и их очень трудно исследовать,
то и в последующие годы точное число
хромосом у человека служило предметом
споров и дискуссий. Однако постепенно
было достигнуто согласие между
исследователями по этому вопросу, и в
течение
30 лет
большинство цитогенетиков считало, что
у человека диплоидное число хромосом
равно 48,
а гаплоидное
- 24.
Усовершенствованные методы изучения
хромосом позволили получить более
точные сведения о количестве хромосом
в клетках у человека, а также выявить
аномалии нормального кариотипа,
ответственные за некоторые уродства.
Особенно плодотворным оказались два
метода:
1. Обработка культуры клеток алкалоидом колхицином, который ведет к накоплению делящихся клеток на стадии метафазы;
2. Обработка клеток слабыми растворами солей, вызывающими набухание, расправление хромосом, что облегчает их исследование.
В 1956 г. шведские цитологи Дж. Тийо и А. Леван изготовили культуры клеток из тканей легких, взятых у абортированных человеческих эмбрионов и, используя усовершенствованную методику обработки клеток, получили необычайно четкие препараты, в которых ясно было видно 46 хромосом. 5
Несколькими месяцами позднее Ч. Форд и Дж. Хаммертон в Англии установили, что диплоидные предшественники половых клеток в семенниках мужчин (сперматогонии) также имеют по 46 хромосом, а гаплоидные (сперматоциты 1-го деления) - по 23 хромосомы.
После этого были изучены многие клетки из разных органов и тканей человека и везде нормальное число хромосом оказалось равным 46.
Женский кариотип отличается от мужского только одной половой хромосомой. Остальные 22 пары одинаковы у мужчин и женщин. Эти 22 пары хромосом называются аутосомами. Нормальный кариотип состоит из 44 аутосом (22 пары) и двух половых хромосом - XX у женщин и XY у мужчин, т. е. женский кариотип имеет две большие половые хромосомы, а мужской - одну большую и одну маленькую.
В половых клетках человека находится одинарный (гаплоидный) набор хромосом - 23, а в соматических клетках - двойной (диплоидный) набор - 46. Эти открытия стимулировали дальнейшее изучение хромосом. Были разработаны методы исследования хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови и на других объектах. В настоящее время хромосомы относительно легко исследуют в лимфоцитах периферической крови. Венозную кровь помещают в специальную питательную среду, добавляют фитогемаглютинин, который стимулирует клетки к делению, и помещают на 72 ч. в термостат. За 6 ч. до конца инкубации сюда добавляют колхицин, который задерживает процесс деления клеток на стадии метафазной пластинки. Затем культуру помещают в гипотонический раствор NaCl, в котором клетки набухают, что приводит к легкому разрыву оболочек ядра и переходу хромосом в цитоплазму. После этого препараты окрашивают ядерными красителями, в частности ацетоорсеином, и рассматривают их в световом микроскопе с иммерсией.
Под микроскопом учитывают общее количество хромосом, фотографируют их, затем из фото вырезают ножницами каждую хромосому и наклеивают на чистый лист бумаги в ряд, начиная от самой большой (первой) хромосомы и кончая самой маленькой (двадцать второй) и половой Y-хромосомой. Люминесцентная методика позволяет быстро и просто проводить массовые исследования с целью выявления больных с различными типами хромосомных аномалий. Совокупность количественных (число хромосом и их размеры) и качественных (морфология хромосом) признаков диплоидного набора единичной клетки обозначается термином «кариотип». Строение хромосом изменяется в зависимости от стадии деления клеток (профазы, метафазы, анафазы, телофазы).
Уже в профазе митоза видно, что хромосома образована двумя взаимно переплетающимися нитями одинакового диаметра - хроматидами. В метафазе хромосома уже спирализована, и две ее хроматиды ложатся параллельно, разделенные узкой щелью. Каждая хроматида состоит из двух полухроматид. В результате митоза хроматиды материнской хромосомы становятся сестринскими хромосомами, а полухроматиды - их хроматидами. В основе хроматид лежат хромонемы - так называют более тонкие нити ДНП, состоящие из белка и нуклеиновых кислот.
В интерфазе
(промежуток между двумя делениями
клеток) хроматин тесно связан с
ядерными мембранами и ядерным белковым
матриксом. Он образует также большие
участки деспирализованных нитей
ДНП. Затем постепенно хроматин
спирализуется, образуя типичные
метафазные х
ромосомы.
Размеры их варьируют от
2 до
10 микрон.
В настоящее время интенсивно исследуются структурные особенности аутосом и половых хромосом (на клетках костного мозга, лимфоцитах, фибробластах, клетках кожи, регенерирующей печени).
Вхромосомах выявлены структуры, названные хромомерами. Хромомер - это спирализованный участок хромонемы. Промежутки между хромомерами представлены хромонемными нитями. Расположение хромомеров на каждой хромосоме строго фиксировано, наследственно детерминировано.
Хромомер - сравнительно крупная генетическая единица, сравнимая по длине с хромосомой кишечной палочки. Строение и функция хромомера - основная загадка современной генетики. Предполагают, что некоторые хромомеры - это один генетический локус, где есть один структурный ген и много генов регуляторных. Возможно, в других хромомерах располагается несколько структурных генов.
Хромонемы и хромомеры окружены неокрашивающимся веществом - матриксом. Полагают, что матрикс содержит дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты, белки.
Определенные участки хромосом образуют ядрышки. Ядрышки - это более или менее деспирализованные участки хромосом, окруженные продуктами деятельности генов (рибосомы, частицы РНК и т. п.). Здесь идет синтез рибосомальной РНК, а также осуществляются определенные этапы формирования рибосом. В нем синтезируется большая часть РНК клетки.
В метафазной хромосоме различают еще несколько образований: центромеру, два плеча хромосомы, теломеры и спутник.
Центромерный (meros - по-гречески, часть) участок хромосомы - это неокрашивающийся разрыв в хромосоме, видимый на препарате хромосом. Центромера содержит 2-3 пары хромомер, имеет сложное строение. Предполагают, что она направляет движение хромосомы в митозе. К центромерам прикрепляются нити веретена.
Теломеры - специальные структуры на концах хромосом - также имеют сложное строение. В их состав входит несколько хромомер. Теломеры предотвращают концевое присоединение метафазных хромосом друг к другу. Отсутствие теломеров делает хромосому «липкой» - она легко присоединяется к другим фрагментам хромосом.
Одни участки хромосомы называются эухроматиновыми, другие - гетерохроматиновыми. Эухроматиновые районы хромосом - это генетически активные участки, они содержат основной комплекс функционирующих генов ядер. Потеря даже мельчайшего фрагмента эухроматина может вызвать гибель организма. Гетерохроматиновые районы хромосом - обычно сильно спирализованы и, как правило, генетически мало активны. В гетерохроматине находится ядрышковый организатор. Потеря даже значительной части гетерохроматина часто не приводит организм к гибели. Гетерохроматиновые участки хромосомы реплицируются позднее, чем эухроматиновые. Следует помнить, что эухроматин и гетерохроматин - это не вещество, а функциональное состояние хромосомы.
Если расположить фотографии гомологичных хромосом по мере возрастания их размеров, то можно получить так называемую идиограмму кариотипа. Таким образом, идиограмма - это графическое изображение хромосом. На идиограмме пары гомологов располагаются рядами в порядке убывающего размера.
У человека на идиограмме среди 46 хромосом различают три типа хромосом в зависимости от положения в хромосоме центромер:
1. Метацентрические - центромера занимает центральное положение в хромосоме, оба плеча хромосомы имеют почти одинаковую длину;
2. Субметацентрические - центромера располагается ближе к одному концу хромосомы, в результате чего плечи хромосомы разной длины.
Классификация хромосом человека по размеру и расположению центромера |
||
Группа хромосом |
Номер по кариотипу |
Характеристика хромосом |
1 и 3 почти метацентрические и 2-крупная субметацентрическая |
||
крупные субакроцентрические |
||
средние субметацентрические |
||
средние акроцентрические |
||
мелкие субметацентрические |
||
самые мелкие мегацентрические |
||
самые мелкие акроцентрические |
||
Х-хромосома (относится к III группе |
средняя почти метацентрическая |
|
Y-хромосома |
мелкая акроцентрическая |
3. Акроцентрические - центромера находится у конца хромосомы. Одно плечо очень короткое, другое длинное. Хромосомы не очень легко отличать одну от другой. Цитогенетики с целью унификации методов идентификации хромосом на конференции в 1960 г. в г. Денвере (США) предложили классификацию, учитывающую величину хромосом и расположения центромер. Патау в том же году дополнил эту классификацию и предложил разделить хромосомы на 7 групп. Согласно этой классификации, к первой группе А относятся крупные 1, 2 и 3 суб- и акроцентрические хромосомы. Ко второй группе В - крупные Субметацентрические пары 4-5. К третьей группе С относятся средние субакроцентрические (6-12 пары) и Х-хромосома, которая по величине находится между 6 и 7 хромосомами. К группе Д (четвертой) относятся средние акроцентрические хромосомы (13, 14 и 15 пары). К группе Е (пятой)- мелкие Субметацентрические хромосомы (16, 17 и 18 пары). К группе F (шестой) мелкие метацентрические (19 и 20 пары), а к группе G (седьмой) - самые мелкие акроцентрические хромосомы (21 и 22 пары) и мелкая акроцентрическая половая Y-хромосома (табл. 4).
Существуют и другие классификации хромосом (Лондонская, Парижская, Чикагская), в которых развиты, конкретизированы и дополнены положения Денверской классификации, что в конечном итоге облегчает идентификацию и обозначение каждой из хромосом человека и их частей.
Акроцентрические хромосомы IV группы (Д, 13-15 пары) и группы VII (G, 21-22 пары) на коротком плече несут маленькие дополнительные структуры, так называемые сателлиты. В некоторых случаях эти сателлиты являются причиной сцепления хромосом между собой при делении клеток в мейозе, вследствие чего происходит неравномерное распределение хромосом. В одной половой клетке оказывается 22 хромосомы, а в другой - 24. Так возникают моносомии и трисомии по той или иной паре хромосом. Фрагмент одной хромосомы может присоединиться к хромосоме другой группы (например, фрагмент 21 или 22 присоединяется к 13 или 15). Так возникает транслокация. Трисомия 21-й хромосомы или транслокация ее фрагмента являются причиной болезни Дауна.
Внутри семи этих групп хромосом на основании лишь внешних различий, видимых в простой микроскоп, провести идентификацию хромосом почти невозможно. Но при обработке хромосом акрихини притом и при помощи ряда других методов окраски их можно идентифицировать. Известны различные
способы дифференциальной окраски хромосом по Q-, G-, С-технике (А. Ф.Захаров, 1973) (рис. 27). Назовем некоторые методы идентификации индивидуальных хромосом человека. Широко применяются различные модификации так называемого метода Q. Например, метод QF - с использованием флюорохромов; метод QFQ - с использованием акрихина; метод QFH - с использованием специального красителя фирмы «Хекст» № 33258, выявляющего повторяющиеся последовательности нуклеотидов в ДНК хромосом (сателлитную ДНК и т. п.). Мощным средством изучения и индивидуальной характеристики хромосом являются модификации трипсинового метода GT. Назовем, например, GTG-метод, включающий обработку хромосом трипсином и окраску красителем Гимза, GTL-метод (обработка трипсином и окраска по Лейтману).
Известны методы с обработкой хромосом ацетатными солями и красителем Гимза, методы с использованием гидроокиси бария, акридиноранжа и другие.
ДНК хромосом выявляется при помощи реакции Фельгена, окраски метиловым зеленым, акридиноранжем, красителем № 33258 фирмы «Хекст». Акридиноранжевый краситель с ДНК однонитчатой образует димерные ассоциаты и дает красную люминесценцию, с двунитчатой спиральной ДНК образует одномерные ассоциаты и люминесцирует зеленым светом.
Измеряя интенсивность красной люминесценции, можно судить о количестве свободных мест в ДНП и хроматине, а отношение зеленая - красная люминесценция - о функциональной активности хромосом.
Гистоны и кислые белки хромосом выявляются при различных рН окраской бромфенодовым синим, зеленым прочным, серебрением, иммунолюминесцентным методом, РНК - окраской галлюцианиновыми квасцами, красителем фирмы «Хекст» № 1, акридиноранжем при нагревании до 60°.
Широко применяются электронная микроскопия, гистоавторадиография и ряд других методов.
В 1969 г. шведский биолог Т. Касперссон и его сотрудники показали, что хромосомы, окрашенные горчичным акрихином и освещенные под микроскопом Наиболее длинноволновой частью ультрафиолетового спектра, начинают люминесцировать, причем одни участки хромосом светятся ярче, другие слабее. Причина этого - разный химический состав поверхности хромосомы. В последующие годы исследователи обнаружили, что концы Y-хромосомы человека светятся ярче любой другой хромосомы человека, поэтому Y-хромосому легко заметить на препарате.
Акрихиниприт преимущественно связывается с ГЦ-парами ДНК. Флюоресцируют отдельные диски гетерохроматиновых участков. Удаляют ДНК - свечение исчезает. Составлены карты флюоресцирующих хромосом. Из 27 видов млекопитающих только у человека, шимпанзе, гориллы и орангутанга светятся Y-хромосомы. Свечение связано с повторами генов, которые появились в эволюции 20 млн. лет назад.
Итак, в норме в соматических клетках человека находится 46 хромосом (23 пары), а в половых - 23 хромосомы, по одной хромосоме каждой пары. При слиянии сперматозоида и яйцеклетки в зиготе количество хромосом удваивается. Таким образом, каждая соматическая клетка организма человека содержит один набор отцовских хромосом и один набор материнских хромосом. Если у человека 46 хромосом, то у различных обезьян число хромосом равно 34, 42, 44, 54, 60, 66.
При действии ультразвука или высокого давления можно добиться разрыва нитей ДНК, которые входят в состав хромосомы, на отдельные фрагменты. Подогревая растворы ДНК до температуры 80-100°,
можно вызвать денатурацию ДНК, расхождение двух составляющих ее нитей. При определенных условиях разъединенные нити ДНК могут снова реассоциировать в устойчивую двунитчатую молекулу ДНК (реассоциация или ренатурация ДНК). Денатурацию и ренатурацию ДНК можно получить и на препаратах фиксированных хромосом, обрабатывая их соответствующим образом. Если после этого хромосомы окрасить красителем Гимза, то в них выявляется четкая поперечная исчерченность, состоящая из светлых и темных полос. Расположение этих полос в каждой хромосоме разное. Таким образом, по «Гимза-дискам» можно также идентифицировать каждую из 23 пар хромосом.
Этими и другими методиками, особенно гибридизацией соматических клеток различных животных и человека, пользуются для картирования хромосом, т. е. для определения положения разных генов в той или иной хромосоме. В настоящее время в аутосомах и половых хромосомах человека картировано около 200 генов.
На конец 1975 г. было локализовано следующее количество генов в различных хромосомах человека (А. Ф. Захаров, 1977): 1 хромосома - 24 гена; 2 хромосомы - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14-3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y-хромосома - 2; Х-хромосома - 95 генов.
Цитогенетический метод
Идеограмма хромосом.
Идиограмма - графическое изображение отдельных хромосом со всеми их структурными характеристиками.
Генетика соматических клеток.
С помощью этих методов изучают наследственность и изменчивость соматических клеток, что в значительной мере компенсирует невозможность применения к человеку метода гибридологического анализа.
Методы генетики соматических клеток, основанные на размножении этих клеток в искусственных условиях, позволяют не только анализировать генетические процессы в отдельных клетках организма, но благодаря полноценности наследственного материала, заключенного в них, использовать их для изучения генетических закономерностей целостного организма.
В связи с разработкой в 60-х гг. XX в. методов генетики соматических клеток человек оказался включенным в группу объектов экспериментальной генетики. Благодаря быстрому размножению на питательных средах соматические клетки могут быть получены в количествах, необходимых для анализа. Они успешно клонируются, давая генетически идентичное потомство. Разные клетки могут, сливаясь, образовывать гибридные клоны. Они легко подвергаются селекции на специальных питательных средах и долго сохраняются при глубоком замораживании. Все это позволяет использовать культуры соматических клеток, полученные из материала биопсий (периферическая кровь, кожа, опухолевая ткань, ткань эмбрионов, клетки из околоплодной жидкости), для генетических исследований человека, в которых используют следующие приемы: 1) простое культивирование, 2) клонирование, 3) селекцию, 4) гибридизацию.
Культивирование позволяет получить достаточное количество клеточного материала для цитогенетических, биохимических, иммунологических и других исследований.
Планирование - получение потомков одной клетки; дает возможность проводить в генетически идентичных клетках биохимический анализ наследственно обусловленных процессов.
Селекция соматических клеток с помощью искусственных сред используется для отбора мутантных клеток с определенными свойствами и других клеток с интересующими исследователя характеристиками.
Гибридизация соматических клеток основана на слиянии совместно культивируемых клеток разных типов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Для гибридизации могут использоваться клетки от разных людей, а также от человека и других животных (мыши, крысы, морской свинки, обезьяны, джунгарского хомячка, курицы).
Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении обычно «теряют» хромосомы предпочтительно одного из видов. Например, в гибридных клетках «человек - мышь» постепенно утрачиваются все хромосомы человека, а в клетках «человек - крыса» - все, кроме одной, хромосомы крысы, с сохранением всех хромосом человека. Таким образом можно получать клетки с желаемым набором хромосом, что дает возможность изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах.
Постепенная потеря хромосом человека из гибридных клеток параллельно с изучением ферментов дает возможность судить о локализации гена, контролирующего синтез данного фермента, в определенной хромосоме.
Благодаря методам генетики соматических клеток можно изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. Они позволяют судить о генетической гетерогенности наследственных болезней, изучать их патогенез на биохимическом и клеточном уровнях. Развитие этих методов определило возможность точной диагностики наследственных болезней в пренатальном периоде.
Цитогенетический метод используется для диагностики пола и анализа хромосомных заболеваний.
Диагностика пола производится с помощью анализа Х-хроматина в клетках крови или буккального эпителия. Х-хромосома образует, так называемое, тельце Барра, У-хромосома — F-тельце.
Для анализа хромосомных аномалий используют различные методы окраски:
рутинная окраска — дает возможность выявить нарушения числа хромосом, т.к. они окрашиваются в равномерно черный цвет.
дифференциальные методы дают возможность окрасить хромосомы неравномерно, выделяя светлые и темные участки. При таком окрашивании можно выявить не только числовые нарушения, но и структурные изменения хромосом.
Показания для использования цитогенетического метода:
1.Если при клиническом обследовании у пробанда обнаружены признаки хронических болезней, но диагноз не установлен.
2.При диагностике наследственных болезней, характеризующихся хромосомной нестабильностью.
3.При определении прогноза потомства, если в родословной имеются лица с хромосомными болезнями.
4.При многократных спонтанных абортах, мертворождениях и наличии нескольких детей с врожденными пороками развития.
5.У женщин с нарушением репродуктивной функции неясного генеза.
Биохимический метод используется для:
установления дифференцированного диагноза заболевания
выявления гетерозиготности
в дородовой диагностике
С его помощью выясняют нарушения обмена. Показания к биохимическим исследованиям:
умственная отсталость
нарушение психического статуса
нарушение физического развития костей туловища и конечностей, снижение слуха, зрения, ожирение
непереносимость отдельных продуктов и лекарств
Амниоцентез — метод забора и исследования околоплодной жидкости. Используется в пренатальной (дородовой) диагностике. Амниоцентез производят после предварительного УЗ-исследования с помощью которого определяют положение плаценты, срок беременности, исключают грубые пороки развития плода. Амниоцентез производят, как правило, трансабдоминально (прокол передней брюшной стенки). С помощью данного метода определяют:
пол плода. Для этого берут 2-5 мл околоплодной жидкости. После центрифугирования осадок, содержащий слущенные клетки эпителия плода, микрос-копируют для выявления Х- и У-хроматина
кариотип плода. Это дает возможность определить хромосомные заболевания
насл. дефекты обмена определяются б/х анализом амниотической жидкости. В случае выявления аномального плода возможно его абортирование, либо лечение внутриутробно или сразу после рождения.
Просеивающие программы (скрининг). Скрининг означает выявление болезни или дефекта развития с помощью тестов, обследований или процедур, дающих быстрый ответ. Основная цель скрининга — ранее выявление заболевания. В настоящее время более 20 заболеваний можно выявить с помощью скрининга, например: ФКУ, дефекты обмена, анемии, дефекты зрения, слуха, поведения, отклонения в росте, синдром Дауна, дефекты нервной трубки и др. ДНТ — к этой группе относятся анэнцефалия и Анэнцефалия — это отсутствие части головного мозга, костей черепа и мягких тканей. Частота встречаемости 1 на 1000 новорожденных. Дети с анэнцефалией погибают вскоре после рождения вследствие дыхательных расстройств или присоединения инфекции.
Spina bifita — это не закрытие позвоночного канала с отсутствием отдельных частей позвонков, в области дефекта спинной мозг деформирован и оказывается открытым или расположенным непосредственно под кожей. Патология встречается у 1 из 1000 новорожденных, а скрытый дефект лишь одного позвонка — примерно у каждого десятого человека. Прогноз для жизни зависит от протяженности дефекта позвоночника, наличия спинномозговых грыж.
Метод позволяет идентифицировать кариотип (особенность строения и число хромосом), путем записи кариограммы. Цитогенетическое исследование проводится у пробанда, его родителей, родственников или плода при подозрении на хромосомный синдром либо другое хромосомное нарушение.
Для определения кариотипа используют как прямые, так и непрямые методы исследования. В первом случае материал, взятый из костного мозга, лимфатических узлов, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости или других тканей, изучают сразу же после получения. Однако прямой метод информативен только тогда, когда в материале имеется достаточное количество метафаз митоза, так как только в этой фазе хромосомы приобретают присущие им особенности строения и возможна их точная идентификация. В настоящее время широко применяются непрямые методы исследования.
Метод приготовления метафазных пластин. Взятую культуру (лимфоциты периферической крови и др.) помещают в питательную среду для культивирования. В норме в периферической крови не наблюдается митоза лимфоцитов, поэтому используют препараты (фитогемагглютинин), стимулирующие иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Вторым этапом является остановка митотического деления клетки на стадии метафазы. Достигается это путем добавления в культуру тканей за 2-3 часа до окончания культивирования препаратов колхицин или колцимед. На третьем этапе, используя гипотонический раствор хлорида кальция или цитрат натрия, добиваются гипотонизации клеток, в результате чего клетка набухает, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся, и хромосомы свободно плавают в цитоплазме. Далее полученная культура фиксируется смесью метанола и уксусной кислоты, центрифугируется и меняется фиксатор. Суспензия с фиксатором наносится на чистое предметное стекло, где метафазная пластинка расправляется и в ее пределах располагаются отдельно лежащие хромосомы. По мере высыхания фиксатора, клетка прочно прикрепляется к стеклу. Таким образом, независимо от культуры клеток, из которых были получены метафазные пластинки общий принцип получения препаратов следующий: накопление метафаз, гипотонизация, фиксация, раскапывание на предметное стекло.
Окраска препарата. Окраска препаратов является следующей стадией после получения метафазных пластин и делится на простые, дифференцированные и флюоресцентные. Каждая из видов окрашивания применяется для выявления только определенных изменений кариотипа. При простой окраске (метод окраски по Гимзе), возможно лишь групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа. Простая окраска широко применяется для изучения хромосомного мутагенеза при проверке факторов окружающей среды на мутантность. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине, контурируя при этом центромеру, спутники и вторичные перетяжки. Дифференциальное окрашивание обусловлено способностью к избирательному окрашиванию по длине и обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающееся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (темные и светлые), которые специфичны для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Наиболее часто используется G-окраска. При этом хромосомы предварительно обрабатываются протеазой или солевым раствором. Для изучения мутационного процесса у человека широко используется метод дифференциальной окраски сестринских хроматид, основанный на способности включатся в последовательность репликации хромосомы аналога тимидина-5-бромдезоксиуридина. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо, поэтому используя этот метод можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку.
Исследование полового хроматина. Метод определения полового хроматина быстрее и проще, чем исследование набора хромосом (кариотипа), поэтому он применяется в качестве одного из скрининг-тестов при массовых обследованиях населения. В норме в клетках женского организма при определенных способах окраски вблизи ядерной мембраны образуется интенсивно окрашиваемое тельце - половой хроматин, или тельце Барра, которое образуется одной, неактивной Х-хромосомой. Другая Х-хромосома в клетках женского организма является активной. У мужчин имеется лишь одна Х-хромосома, и она всегда активна, поэтому в ядрах клеток мужского организма половой хроматин не определяется. Для исследования полового хроматина Х обычно берут соскоб со слизистой полости рта. Наиболее распространен экспресс-метод окраски по Сандерсу с использованием 2% раствора уксуснокислого ацетоорсеина с последующей иммерсионной микроскопией. Кроме того, в зрелых нейтрофилах крови выявляется еще и так называемая барабанная палочка, причем телец хроматина и барабанных палочек на единицу меньше числа Х-хромосом. В нейтрофилах у мужчин выявляются также околоядерные образования в виде «ниточек» и «волосков». Исчезновение у женщин неактивной Х-хромосомы ведет к отсутствию полового хроматина. Появление у мужчины дополнительной Х-хромосомы приводит к формированию тельца полового хроматина.
Показания для цитогенетического обследования больного:
- 1) множественные пороки развития (с вовлечением трех и более систем); наиболее постоянные нарушения - пороки рзвития головного мозга, опорно-двигательной системы, сердца и мочеполовой системы;
- 2) умственная отсталость в сочетании с нарушениями физического развития, дисплазиями, гипогенитализмом;
- 3) стойкое первичное бесплодие у мужчин и у женщин при исключении гинекологической и урологической патологии;
- 4) привычное невынашивание беременности, особенно на ранних стадиях;
- 5) нарушение полового развития (гипогонадизм, половые инверсии);
- 6) небольшая масса ребенка, рожденного при доношенной беременности.
Применение цитогенетического метода в клинической генетике обусловило развитие нового направления - клинической цитогенетики, которая позволяет:
- - установить происхождение структурно перестроенных хромосом и их точную классификацию;
- - выделить синдромы, обусловленные дисбалансом по участкам индивидуальных хромосом;
- - накапливать сведения об изменениях хромосом в опухолевых клетках, у больных с наследственными заболеваниями крови и т.д.